Hansjörg Groenert


Freitag, 10.12.1999, 14.30 Uhr:

Zum ersten Male
wurden im Bischöflichen Cusanus Gymnasium in Koblenz
Gene mit Hilfe von Plasmiden in  Bakterienzellen eingeschleust und diese Bakterien geklont.
 
 

Leistungskurs BIO12/3

Leistungskurs BIO13/2

7 blaue und 1077 weiße Kolonien in 50µl ausplattierter Zellsuspension auf LB/Amp/IPTG/X-Gal-Nährboden.
Die blauen Kolonien bestehen aus den mit neu eingeschleusten Genen geklonten Escherichia coli - Bakterien. 
Eine zweite Selektionsplatte mit 100µl ausplattierter Zellsuspension auf LB/Amp/IPTG/X-Gal-Nährboden zeigte 1 blaue und 1611 weiße Kolonien.

Die Schüler der Biologie Leistungskurse Bio13/2 und Bio12/3 führten gemeinsam das sogenannte Blue Genes Experiment  für das Fonds der Chemischen Industrie im Verband der Chemischen Industrie e.V., Frankfurt uns Reagenzien und Geräte im Werte von ca. 2000,-DM zur Verfügung stellte, durch. Beide Klassen wurden vor der Durchführung des Experimentes in allen Einzelschritten mit Theorie, Versuchsablauf  und  Gerätebedienung (je drei Unterrichtsstunden) vertraut gemacht. Da die Unterrichtstunden der beiden Kurse direkt hintereinander lagen, konnte die eine  Klasse  die Versuche mit Übergabeprotokollen an die andere zur Fortführung übergeben. Das Experiment lief von Dienstag bis Freitag und wurde insgesamt 11 Stunden von beiden Klassen zusammen betreut und danach getrennt jeweils eine Stunde ausgewertet. Innerhalb der Klassen wurde teils arbeitsteilig, teils parallel gearbeitet.

Im Experiment wird das lacZ-Gen übertragen. Das lacZ-Gen exprimiert ß-Galktosidase. Lactose und X-Gal (5-Brom-4chlor-3indolyl-ß-D-galktosid) können beide als Substrat von dem Enzym ß-Galktosidase gespalten werden. Während ß-Galktosidase Lactose in Glucose und Galactose spaltet, wird X-Gal hydrolysiert und durch Luftoxidation zu einem blauen, schwer löslichen  Indigofarbstoff umgesetzt. X-Gal dient also zum Nachweis der ß-Galktosidase-Wirkung.  IPTG (Isopropyl-ß-D-Thiogalktosid) wirkt dabei als Induktor und löst den aktiven  Repressor vom Operator des lacZ-Operons. Das in der Abbildung dargestellte Modell wurde mit DYNASYS erstellt.
 
 





Die Versuchsreihe läuft in 4 Schritten ab:
1. Der Plasmidring pBR322  wird durch das Restriktionsenzym NheI geöffnet (Restriktion).
2. Das lacZ-Gen wird in den Plasmidring  pBR322 eingebaut (Ligation).
3. Das entstandene pBR322 lacZ+  wird  in eine LacZ-Mutante von Escherichia coli transformiert (Transformation).
4. Die transformierten Bakterien werden  geklont. Die Bakterienklone mit der neukombinierten DNA werden mit Hilfe des Selektionsmarkers Ampicillin, das der transformierte Plasmidring zusätzlich enthält,  isoliert (Selektion).

Zur Kontrolle wurde nach der Ligation eine DNA-Analyse durch Elektrophorese durchgeführt.
 



 

Zurück zur Homepage

Weitere Auskünfte: Hansjoerg Groenert